益诺思慢病毒整合位点分析赋能in vivo CAR-T产品安全性评价

  In vivo CAR-T（体内CAR-T）技术通过载体将CAR基因直接递送至患者体内T细胞，实现“体内原位编辑”，相比传统体外CAR-T疗法，实现了”即用型”产品，简化治疗流程，大幅度降低成本等特点和优势。目前主流的In vivo CAR-T技术路线分为以脂质纳米颗粒（LNP）为载体的非病毒路径和以改造型慢病毒（Lentivirus，LV）为代表的病毒载体路径。其中以改造型慢病毒为载体的产品因其靶向性更好，细胞转导效率高，表达稳定持久的特点获得青睐。但同时，其整合进入基因组所带来的安全性风险也是备受审批关注的问题。

  在传统的细胞基因治疗（CGT）中，慢病毒（Lentivirus）载体就因其高效、稳定性强、免疫原性低的转染特性，被大范围的应用于CAR-T、干细胞改造及功能基因研究。对其安全性的要求也在一直更新和升级。FDA 于2013 年发布的指南（Guidance for Industry: Preclinical Assessment for Cell and GeneTherapy Products.2013）中，阐述了影响致癌性的因素；2024 年针对 CAR -T 细胞产品发布的指南（Considerations for the Development of CAR-T Cell TherapyProducts.2024）提到，病毒载体整合到宿主基因组会影响致癌性，应基于风险评估确定载体拷贝数（VCN）的放行标准 。在我国，NMPA 于2017年发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》将致癌性评估纳入质量研究和质量控制范畴。2024 年发布的《人干细胞产品非临床研究技术指导原则》对细胞疗法产品致癌性评估的每个方面进行了更全面的描述。

  对于病毒载体安全性和致癌性评估中，病毒携带外源基因插入位点的随机性可能会导致原癌基因的激活、抑癌基因的失活等插入突变风险，因此慢病毒整合位点精准检测成为细胞治疗产品IND评审及临床试验安全性评估的必检内容。

  益诺思慢病毒整合检测的新方法为基于S-EPTS/LM-PCR改良后的方法，并自主设计了3’LTR特异性引物。该方法的原理是：首先通过超声将基因组DNA随机打断成片段，再利用带有生物素标记的引物进行延伸合成。随后对产物进行末端补平，加A后连接Linker，并通过链霉亲和素磁珠富集特异性片段。接着采用特异性引物进行3’LTR的两轮PCR扩增进一步富集片段，最后在接头连接后进行二代测序分析，以此来实现对整合位点的精准捕获。

  在准确性考察中，个人会使用商业化慢病毒整合位点标准品对方法学进行了验证，结果显示本方法学可以准确检出单克隆和多克隆类型的插入位点，插入位点与sanger测序结果吻合，准确率达100%！

  在目标序列扩增和建库测序过程中，每一步实验的精准性与稳定性是保证后期生物信息分析结果可靠的必要条件。我们采用行内认可的品牌建库试剂与精确校准后的实验仪器，对实验过程的每个环节都设置了严格的质控，得到高质量的测序数据。测序后的数据比对到慢病毒与宿主基因组参考序列，以此来实现对整合位点的精准鉴定，并进一步开展多维度分析：

  整合位点统计：对整合事件在全基因组以及不同功能区域的数量和分布做全面解析。

  Shannon指数反应了样本中整合位点数目与整合位点频率的均匀性。样本中整合位点数目越多、频率越均匀，H值就越大。当样本中只有一个整合位点时，Shannon指数达最小值0；当有两个以上整合位点，且每个位点频率相等时，香农指数达到最大值lnS。 Gini系数可用来衡量样本中整合位点频率的均匀程度。其为比例数值，取值范围为0-1，一般来说Gini系数越小，位点频率分布越平均；基尼系数越大，分布越不平均。

  如表3所示，Shannon指数为1.96，Gini系数为1，表明样本中整合事件的数量分布呈现不均一性，符合实验预期。

  整合位点安全性分析：着重关注整合位点是否落在致癌基因（Oncogene）和抑癌基因（TSG）区域，从而为基因治疗安全性评估提供关键参考。如表4所示，样本检出位于致癌基因、抑癌基因外显子区域的整合位点数目为63，这些插入事件并非主克隆插入事件，该检测结果符合预期。

  益诺思临床实测部门已为50余项CGT产品的临床试验提供了生物样本分析检测服务。通过基于S-EPTS/LM-PCR和测序的优化方法与生物信息报告体系的方法学开发和验证，以更高的准确度和灵敏度鉴定病毒载体的整合位点位置和频率，充分挖掘病毒载体的整合事件的相关信息，全面评估插入突变的可能性和相关风险，助力客户顺利完成药品注册申报。